生物基1,3-丙二醇的发酵工艺

1,3-丙二醇（1,3-PDO）是一种重要的化工原料，可作为溶剂应用于油墨、涂料、抗冻剂和润滑剂等行业，也被广泛应用于化妆品、医药和纺织等多个行业。它最主要的用途是作为聚合单体用于合成高性能的高分子材料，特别是合成生物可降解的聚对苯二甲酸丙二醇酯（PTT）。PTT作为一种新型的聚酯纤维，具有良好的柔软性、蓬松性和抗污性，加上本身固有的弹性，以及能常温染色等良好特性，在地毯和纺织行业具有巨大的市场潜力，从而成为当前国际上最新开发的热门高分子新材料之一，因此1,3-PDO拥有巨大的市场需求。目前，1,3-PDO的生产方法包括化学法和生物法，其中生物法以操作条件温和、安全、环保和可持续发展等优势得到国内外广泛关注。微生物发酵法生产1,3-PDO常用的菌种有克雷伯氏杆菌、丁酸梭菌、基因改造的大肠杆菌、弗氏柠檬酸菌以及乳杆菌等。

本课题组20多年来持之以恒地研究微生物发酵法生产1,3-丙二醇，对多种发酵工艺进行了探索、比较和优化，已申请8项发明专利（6项已授权）。本文对课题组所研究的发酵工艺进行汇总，简要介绍各工艺的特点。

1. 两步发酵法生产1,3-PDO

目前尚未发现自然界中存在能将葡萄糖直接转化为1,3-PDO的微生物，而存在将葡萄糖转化为甘油和甘油转化为1,3-丙二醇的菌株。鉴于当时国内甘油价格比较高，为实现廉价葡萄糖到1,3-PDO的转化，我们提出了两步发酵法生产1,3-PDO的工艺路线（图1）。第一步是利用好氧酵母菌发酵葡萄糖或玉米淀粉水解液制备甘油，第二步再用兼性克雷伯氏杆菌将甘油转化为1,3-PDO。此工艺已获授权中国发明专利：两步微生物发酵生产1,3-丙二醇的方法（ZL 01138769.6）。

图1 两步发酵法生产1,3-PDO

2. 微氧发酵生产1,3-PDO

利用兼性克雷伯氏杆菌在微氧条件下生长快的特点，将甘油在较短的时间内转化为1,3-PDO（图2）。理论分析表明，微氧条件有利于提高1,3-丙二醇的得率；间歇发酵实验结果也验证了这个结论，但批式流加发酵实验表明，厌氧条件下的转化率略高于微氧条件。微氧发酵的时间比传统的厌氧发酵缩短一半，也节省了发酵成本。此项技术已获得授权中国发明专利：一种微生物微氧发酵生产1,3-丙二醇的方法（ZL 01117282.7）。

图2 微氧发酵生产1,3-PDO

3. 微氧-厌氧多罐串联连续发酵生产1,3-PDO

以克雷伯氏杆菌为发酵菌种，先微氧促细胞生长，再厌氧提高转化率、消耗过量甘油，形成多罐串联的连续发酵工艺（图3）。在第一个发酵罐中通入0.04 vvm空气，微氧条件促进菌体的生长，同时控制初始甘油浓度和稀释速率防止底物限制或过量；第二个发酵罐中通入0.04 vvm氮气，同时流加甘油使残余甘油浓度处于合理范围内，厌氧条件提高1,3-PDO浓度和转化率；第三个发酵罐进行厌氧培养，进一步消耗残余甘油、提高1,3-PDO的浓度。此工艺已获得授权中国发明专利：一种微氧-厌氧连续流加甘油多罐串联连续发酵生产1,3-丙二醇的方法（ZL 201010192158.5）。

图3 微氧-厌氧多罐串联连续发酵生产1,3-PDO

4. 基于生长与代谢在线调控1,3-PDO的发酵过程

以克雷伯氏杆菌发酵为例，基于其生长与代谢特征在线调控底物流加的发酵工艺（图4）。1,3-PDO的形成是生长耦联型的，通过对细胞生长动力学的分析，建立了发酵对数生长期和稳定期底物消耗与CO₂浓度和碱液消耗之间的函数关系。经两次在线反馈补料发酵实验验证，将甘油浓度控制在20±2 g/L，1,3-PDO的浓度（80.3和78.8 g/L）比手动补料提高了45%和42%。此工艺使发酵过程实现了自动化控制，适用于工业生产。已获得授权中国发明专利：基于生长和代谢特征的底物流加发酵生产1,3-丙二醇的控制方法（ZL 201010165846.2）。

图4 基于生长和代谢特征的底物流加发酵生产1,3-PDO

5. 微生物菌群发酵生产1,3-PDO

共筛选出4组可以生产1,3-PDO的混合菌群：

①耐高渗兼性混合菌群DL38，以克雷伯氏杆菌为优势菌，可采用海水配制的培养基，在不灭菌的条件下进行发酵。该混合菌群可耐受超过单菌理论值的甘油浓度（200 g/L纯甘油），且不产2,3-丁二醇。已获得授权中国发明专利：一种混菌发酵甘油生产1,3-丙二醇的方法（ZL 201510212125.5）。

②厌氧混合菌群C2-2M，以丁酸梭菌为优势菌，可利用粗甘油发酵。该菌群比单菌表现出更强的底物适应能力，两步脉冲批式流加发酵1,3-PDO浓度达到82.66 g/L，生产强度达3.06 g/(L•h)。连续发酵性能稳定，最高可产57.86 g/L 1,3-PDO。已获得授权中国发明专利：一种发酵生产1,3-丙二醇的微生物混合菌群及发酵方法（ZL 201611059532.8）。

③厌氧与兼性菌互生菌群DUT08，以丁酸梭菌为主，含有埃希氏菌属和克雷伯氏杆菌。此菌群可进行微氧发酵，克雷伯氏杆菌可为严格厌氧菌丁酸梭菌营造厌氧发酵环境，节省发酵成本。该菌群可产61.49 g/L 1,3-PDO，转化率为0.55 g/g，生产强度为2.46 g/(L•h)。已申请中国发明专利：一种改变通气条件调控产物的多细胞体系及发酵方法（201810789960.9）。

④微生物混合菌群LS30，以肠杆菌属和埃希氏菌属为主，可以利用地沟油制备生物柴油副产的粗甘油，并用海水配置培养基进行发酵生产1,3-PDO和乳酸。

微生物菌群相比单菌在甘油耐受、杂质耐受、环境压力耐受、产物类型、生产水平等方面表现出明显的优势。自然状态下的微生物菌群具有一定的优越性和合理性，可以通过单菌之间的相互作用达到稳定且较高的发酵水平。

6. 序列接种发酵生产1,3-PDO

以丁酸梭菌为发酵菌种，将前一罐处于对数生长期的细胞作为菌种接到后一罐中，依次进行序列接种发酵（图5）。当第一罐发酵进行至10 h时，将2%的发酵液转移到第二个发酵罐中，开始新的发酵，首个发酵罐继续发酵至结束。重复上述过程，直到完成8罐发酵。8批次发酵中1,3-PDO平均浓度为84.62 g/L，平均转化率为0.52 g/g，单罐1,3-丙二醇平均生产强度为3.05 g/(L•h)。该工艺节省了种子培养时间，减少发酵步骤，可在100 h内完成8罐发酵，提高了生产效率。已申请中国发明专利：一株高产1,3-丙二醇的丁酸梭菌及一种序列接种发酵工艺（201910838790.3）。